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Die Kryo-Elektronenmikroskopie verändert unser Bild von der Zelle

von Rasmus R. Schröder


Wie laufen Lebensprozesse in Pflanzen und Tieren ab? Wie greifen Regelkreise in Zellen und Organen ineinander, und wie funktioniert die makromolekulare Maschinerie in unserem Körper? Solche Fragen stellen sich uns – als selbst reflektierenden Organismen – immer wieder aufs Neue. Der Versuch, sie zu beantworten, kann vielfältig angegangen werden – in unserer Forschergruppe steht die Struktur-Funktions-Beziehung im Vordergrund. Wir fragen uns beispielsweise, wie eine bestimmte Funktion – etwa die  Kontraktion eines Muskels oder das Bereitstellen von Energie in der Zelle – von der Struktur der Reaktionspartner abhängt, die an diesem Prozess beteiligt sind.

Mit Struktur ist die Morphologie des Systems gemeint. Es kann – je nach Fragestellung – aus wenigen interagierenden Proteinen bestehen, aus größeren Komplexen von Biomolekülen, aus einzelnen Zellen oder Zellverbänden. Die „Strukturbiologie“ liefert also letztlich Informationen über die räumlichen Zusammenhänge und Abhängigkeiten einzelner Lebensfunktionen.

Die untersuchten Systeme können sehr unterschiedlichen Größenordnungen angehören: Bei der Morphologie eines zellulären Systems denken wir in einer Längenskala von einigen 0,01 Millimetern, bei der eines einzigen Proteinmoleküls an einige 0,1 Nanometer. Wir benötigen deshalb  Techniken, die es uns erlauben, die Struktur biologischer Systeme in einem Abbildungsbereich von vielen Größenordnungen bis hinunter zur quasi-atomaren Auflösung zu untersuchen.

Die Elektronenmikroskopie hat sich in den letzten Jahren als die wichtigste abbildende Methode der Strukturbiologie herausgebildet. Ursprünglich war das Abbilden chemisch fixierter Proben eines der wichtigsten Werkzeuge zellbiologischer Forschung. Der Sprung in die Strukturbiologie gelang aber erst in den letzten zwei Jahrzehnten: durch das  Entwickeln der Kryo-Fixierung und der Mikroskopie von Kryo-Proben. Der Übergang vom Abbilden chemisch fixierter Artefakte hin zur Mikroskopie an quasi-nativen, also gleichsam lebenden Systemen, war dabei der herausragende Technologieschub.

Ein Mensch besteht zu etwa 70 Prozent aus Wasser. Es ist daher nicht verwunderlich, dass Aussagen über Lebensprozesse nur sehr bedingt zu treffen sind, wenn man chemisch fixierte biologische Proben mit dem Elektronenmikroskop unter Vakuumbedingungen abbildet. Heute schauen wir uns die wässrigen Systeme in ihrer quasi-nativen Form als sogenannte vitrifizierte Proben an: Dazu werden die Proben, beispielsweise Proteinsuspensionen oder zelluläre Verbände, derart schnell eingefroren, dass dabei keine zerstörerischen Eiskristalle entstehen können. Stattdessen bildet sich ein glasartig verfestigtes Wasser (das Wort „Vitrifikation“ leitet sich vom lateinischen vitrum, „Glas“, ab), in dem biologische Strukturen unverändert erhalten bleiben. Dünne Schichten der vitrifizierten Proben können anschließend mit modernen Kryo-Mikroskopen abgebildet werden. Es gelingt beispielsweise, isolierte Bio-Makromoleküle abzubilden und deren dreidimensionale Struktur in quasi-molekularer Auflösung zu rekonstruieren.

Wir haben auf diese Weise in den vergangenen Jahren zusammen mit Kenneth C. Holmes vom Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung in Heidelberg ein Funktionsmodell des makromolekularen Motors Myosin entwickelt. Es kann wesentliche Schritte der Muskelkontraktion erklären.

Startpunkt unserer Arbeit waren molekulare Strukturmodelle von Aktin und Myosin, den beiden Hauptakteuren der Muskelkontraktion. Die Proteine Aktin und Myosin bilden in den Muskelfasern spiralförmige (helikale) Strukturen (Filamente), die aufgrund einer Relativbewegung bewirken, dass Muskelfasern sich verkürzen. Die koordinierte Relativbewegung der Filamente nehmen wir als Kraft­-erzeugung oder Bewegung wahr. Auf der Ebene der Einzelmoleküle entspricht dies einem Kreisprozess, den der molekulare Motor Myosin ausführt, indem er mit einem Aktin-Filament wechselwirkt. Myosin bindet dazu ein energietragendes Molekül (Adenosin-Triphosphat, ATP) und spaltet es, um die Energie seinerseits in einer Konformationsänderung zu speichern. Bindet Myosin wieder an das Aktin-Filament, löst dies eine neuerliche Konformationsänderung aus, die den Motor entlang des Aktin-Filaments bewegt.

Während die Struktur der daran beteiligten Einzelmoleküle mit der sogenannten Röntgenkristallographie aufgeklärt werden konnte, ist der Motor – also Myosin in seiner Wechselwirkung mit Aktin – nur im Elektronenmikroskop mit höchster Auflösung abzubilden. Eingebettet in einer vitrifizierten Eisschicht erscheinen die ATP-freien, fest an das Filament gebundenen Motordomänen des Myosins wie eine Kette von Pfeilspitzen. Die Abbildung einer solchen Kyro-Probe ist allerdings mit einem hohen Untergrundrauschen behaftet. Außer­dem wird die Information über die räumliche Struk­tur des Objekts durch die Projektion im Mikroskop in einen zweidimensionalen „Schattenwurf“ umge­wandelt.

Hier helfen heute die digitale Bildverarbeitung und die numerische Kombination der Information einzelner Projektionen unter verschiedenen Winkeln. So wurde in den letzten zwei Jahrzehnten die sogenannte Einzelpartikel-Rekonstruktion entwickelt; und in unserem speziellen Fall des Aktin-Myosin-Komplexes half uns dessen helikale Struktur weiter. Wie im Falle einer axialen Tomographie liefert uns das Bild des spiralförmigen Filaments viele verschiedene Ansichten, die wir durch einen neu entwickelten Algorithmus zu einer drei­dimensionalen Struktur mit sehr hoher Abbildungsauflösung rekonstruieren können. Ein einziges Bild der helikalen Struktur ist ausreichend, um seine gesamte drei­dimensionale Struktur zu be­rechnen.

Was lernt man aus einer solchen Struktur? In unserem Fall waren ja die Strukturmodelle der unabhängigen Proteine bereits bekannt; und da die Auflösung der dreidimensionalen Rekonstruktion ausreichend genau war, konnten wir die quasi-atomaren Modelle in unser berechnetes Komplexvolumen einpassen. Dabei sahen wir, dass ein Teil des Myosins nicht in unseren Komplex passen wollte: Erst eine Konformationsänderung des Moleküls würde molekulares Modell und Rekonstruktion zur Übereinstimmung bringen. Soweit die rein morpholo­gische Beobachtung. Hätte aber eine derartige Strukturänderung zwischen Einzelkomponenten und Komplex auch einen biologischen Sinn?

Aus dem Zusammenspiel der postulierten Konformationsänderung und deren Effekt auf die restliche Struktur des Moleküls lässt sich tatsächlich auf die Funktion rückschließen: Myosin kann ohne die Wechselwirkung mit Aktin nur sehr langsam den Spaltungszyklus des ATP-Moleküls durchlaufen. Mit der Bindung an Aktin erfolgt dies um Größenordnungen schneller. Was ist der Grund dafür?

Die von uns im Komplex beobachtete Konformationsänderung erklärt dies durch eine geänderte Bindungsstruktur des gespaltenen ATPs. Die Bindung an Aktin löst im Myosin-Molekül somit zwei Konformationsänderungen aus: Zum einen werden Überreste des gespaltenen ATP-Moleküls freigesetzt, zum anderen muss der eigentliche „Ruderschlag“ des Motors ausgelöst werden. Unsere neueren Arbeiten mit Aktin und Myosin sind genau auf diesen Punkt hin ausgerichtet. Mit verschiedenen Mutanten des Proteins Myosin und mit einer noch höheren strukturellen Auflösung der Rekonstruktion wollen wir versuchen, die Konfor­mationsänderung des Ruderschlags zu visualisieren.

Das Beispiel des Aktin-Myosin-Systems zeigt, wie durch die Kombination  röntgenkristallographischer Strukturmodelle mit  elektronenmikroskopischer Rekonstruktion – und damit der Kombination von Strukturen unterschiedlicher Längen- beziehungsweise Auflösungsskalen – das molekulare Funktionsmodell eines Prozesses gewonnen werden kann.

Das Ziel, ein entsprechendes Funktionsmodell auch für die gekoppelten Prozesse der komplexen zellulären Systeme zu gewinnen, ist der in den letzten Jahren neu formulierte Anspruch der Kryo-Elektronentomographie. Die Kombination von Multiskalen-Strukturen soll zu einem quasi-atomaren Modell der Zelle führen. Unseres Erachtens ist der Weg dorthin noch weit. Aber durch die intelligente Präparation von Subsystemen einer Zelle und neue methodische Ansätze der Elektronentomographie scheint das Ziel dennoch nicht unrealistisch.

In unserer Gruppe haben wir als Beispiel für ein komplexes zelluläres System die Dimer-Struktur der ATP-Synthase-Moleküle in der Mitochondrien-Membran untersucht. Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zelle, sie besitzen eine sehr spezialisierte Proteinkomplex-Ausstattung, deren Membran-Morphologie gewisse Eigenarten zeigt. Um die aufgrund biochemischer Untersuchungen vermuteten Molekül-Dimere in ihrer nativen Umgebung zu verifizieren, mussten komplette Membranen in ihrer dreidimensionalen Struktur untersucht werden – eine typische Probe für die Leistungsfähigkeit der Kryo-Elektronenmikroskopie. Wie im Falle der Einzelmolekül-Rekonstruktion müssen hierbei Aufnahmen aus verschiedenen Projektionsrichtungen kombiniert werden; der Unterschied aber ist, dass diesmal nur eine einzige und zudem einzigartige Probenstelle verfügbar ist. Man muss also ein- und dieselbe Probenstelle mehrfach gegen den abbildenden Strahl gekippt aufnehmen.

Da aber Kryo-Proben von nativem biologischen Material im Elektronenstrahl schnell geschädigt werden, müssen die Bilder mit einer sehr geringen Dosis aufgenommen und ein sehr hohes Untergrundrauschen in Kauf genommen werden. Erst in der Rekonstruktion werden die gesuchten Molekülkomplexe sichtbar.

Die Rekonstruktion der Membrankomplexe endete für uns mit einer großen Überraschung. Wir konnten die bislang nur postulierten Dimere tatsächlich abbilden – und erkannten dabei, dass sie in einer bänderartigen Überstruktur organisiert waren. Nachdem wir zwischenzeitlich verschiedene andere Membranstrukturen detailliert analysiert haben, sind wir nunmehr überzeugt davon, dass es diese spezielle Überstruktur der Dimer-Superkomplexe der ATP-Synthase-Moleküle ist, welche die innere Membran der Mitochondrien in ihre ungewöhnliche, stark gekrümmte Morphologie zwingt.

In einem physikalischen Ladungsmodell der von der ATP-Synthase durch die Membran geleiteten Protonen wurde dann sehr schnell ersichtlich, dass diese Membrankrümmung – ähnlich der Effekte an der starken Krümmung eines Blitzableiters – die Funktionsweise der ATP-Synthase-Moleküle positiv unterstützt: Sie strukturieren sich ihre Membranumgebung durch die Superkomplex- und Überstrukturbildung selbst und optimieren dadurch ihre Funktion. Das ist Mikroevolution auf molekularem Niveau – visualisiert durch Kryo-Elektronentomographie an einem zellulären System.

Das bisher Dargestellte illustriert, wie aus der Mikroskopie – also dem reinen Abbilden biologischer Systeme – und daraus ableitbaren Modellen eine quantitative Funktionsbeschreibung biologischer Prozesse gewonnen werden kann. Aus dem Mikroskop als bloßer Bild­gebungsmaschine wird so ein quantitatives Analysege-rät. Diese Weiterentwicklung wird in den nächsten Jahren für die biologische und medizinische Forschung zunehmend an Bedeutung gewinnen. Der Exzellenzcluster „CellNetworks“ der Universität Heidelberg hat daher den Aufbau der Kryo-Elektronenmikroskopie und die Vernetzung möglichst aller mikroskopischen Techniken auf dem Campus in den Mittelpunkt seiner Aktivitäten gestellt. Im nächsten Jahr wird in Heidelberg ein neues  Kryo-Elektronenmikroskop aufgestellt, im Zusammenspiel mit den anderen strukturbiologisch arbeitenden Instituten am Standort wird Heidelberg zu einem Zentrum der struktur- und molekularorientierten Zellbiologie werden.

Um die derzeit noch gegebenen technischen Grenzen zu überwinden, wird auch die methodische Forschung immer wichtiger. So wie die Kryo-Präparation wässriger Proben die Mikroskopie revolutioniert hat, so werden neue, bereits in den nächsten Jahren verfügbare Verbesserungen in der Probenabbildung das Tor zu neuen Anwendungen der Kryo-Mikroskopie öffnen. Wir konzentrieren uns derzeit auf die Entwicklung beziehungsweise Verbesserung der Abbildungstechnik nativer biologischer Proben und untersuchen dazu spezielle Formen der aus der Lichtmikroskopie bekannten Phasenkontrastmikroskopie. Um die im Bild enthaltene Phaseninformation der abbildenden Elektronenwelle zu optimieren, ziehen wir miniaturisierte elektronenoptische Bauelemente heran. Auf diese Weise gelingt es, zelluläre Strukturen in einer Probe sichtbar zu machen, die sonst nicht abzubilden wären.

In enger Zusammenarbeit mit einer Arbeitsgruppe der Universität Karlsruhe und einem Heidelberger Unternehmen wollen wir in den nächsten Jahren versuchen, speziell die Abbildung in der Tomographie zellulärer Systeme weiter zu verbessern.

Mit den Möglichkeiten der Kryo-Elektronenmikroskopie schließt sich in Heidelberg ein Kreis methodischer und biologisch-medizinischer Forschung, der nur wenigen bekannt sein dürfte: Es ist genau 100 Jahre her, dass in Heidelberg Helmut Ruska geboren wurde. Er war der jüngere Bruder von Ernst Ruska, dem Entwickler des Elektronenmikroskops und Nobelpreisträger des Jahres 1986. Wie Ernst Ruska in seiner Biographie beschreibt, kamen beide Brüder sehr früh mit der Mikroskopie und mit optischen Instrumenten in Berührung. Helmut Ruska war es, der nach seiner Promotion bei Ludolf von Krehl an der Universitätsklinik Heidelberg wesentliche Arbeiten auf dem Gebiet der Virologie veröffentlichte und während seiner Zeit als Arzt in der Heidelberger Klinik begann, mit dem Elektronenmikroskop seines Bruders Ernst biologische Proben zu untersuchen. Ihm war es vorbehalten, im Jahr 1940 als erster Viren ab­zubilden und elektronenmikroskopische Bilder von Windpocken-Erregern zu veröffentlichen. Er begründete damit das Arbeitsgebiet der Klassifikation von Viren anhand ihrer Morphologie – das war vielleicht die erste strukturbiologische Anwendung der Elektronenmikroskopie.

Die Kryo-Elektronenmikroskopie wird in unserem Heidelberger Labor im Geiste von Helmut und Ernst Ruska angewendet und weiterentwickelt. Neue biomedizinische Fragen stellen neue Anforderungen an Probenpräparation und Probenabbildung. Das ist eine Herausforderung, die wir durch unsere biologischen Arbeiten selbst vorantreiben und annehmen.

Prof. Dr. Rasmus R. Schröder leitet seit Sommer 2008 die neue Arbeitsgruppe Kryo-Elektronenmikroskopie des Exzellenzclusters „CellNetworks“ der Universität Heidelberg. Zuvor forschte er am Max-Planck-Institut für Medizinische Forschung in Heidelberg und am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt am Main über makromolekulare Motoren und die physikalischen Grundlagen der Bildentstehung in Transmissions-Elektronenmikroskopen. Im Jahr 2006 gelang es seiner Arbeitsgruppe zusammen mit Wissenschaftlern der Universität Karlsruhe erstmals, den der Lichtmikroskopie analogen Phasenkontrast auch im Transmissions-Elektronenmikroskop zu realisieren.
Kontakt: rasmus.schroeder@bioquant.uni-heidelberg.de