Konzert der Moleküle
Blitzschnell und berührungsfrei arbeiten Michael Grunze und sein Team. Am Physikalisch-Chemischen Institut der Universität Heidelberg spüren sie treffsicher Substanzen wie Proteine oder Schwermetallionen in winzigen Mengen auf - mit Hilfe von Schallwellen. Gelöste Moleküle versetzen ihren akustischen Sensor in Schwingung wie eine Saite. Je mehr Teilchen, desto tiefer der "Ton", in der Umweltanalytik ebenso wie in der medizinischen Diagnostik. Für die Zukunft haben sich die Physiker und Chemiker vorgenommen, auch die Verbindung von körpereigenen Proteinen mit den künstlichen Oberflächen medizinischer Materialien zu belauschen.
Der schnelle Nachweis geringster Mengen gelöster Stoffe besitzt besonders in den Bereichen der medizinischen Diagnostik, der Umwelt- und Lebensmittelanalytik sowie der biotechnischen Prozeßkontrolle große Bedeutung. So wird der Stoffwechsel des menschlichen Körpers durch Stoffe beeinflußt und reguliert, die bereits in extrem geringen Mengen eine hohe Wirksamkeit entfalten. Zur Diagnose und Behandlung vieler Krankheiten müssen daher kleinste Konzentrationen dieser Stoffe sehr genau bestimmt werden, zum Beispiel der Insulinspiegel bei Diabetikern oder Tumormarker zur Kontrolle einer Krebstherapie. In der Umweltanalytik interessieren die Konzentrationen von Pestiziden und Schwermetallen im Grundwasser. Um niedermolekulare Bestandteile von Flüssigkeiten zu bestimmen, werden traditionell mehrstufige chemische Trennverfahren eingesetzt. Alternativ finden aber auch physikalische Meßmethoden wie Massenspektrometrie oder Atomemissionsspektroskopie Verwendung. Im Bereich der Immunodiagnostik, die sich im allgemeinen mit dem Nachweis von Proteinen beschäftigt, wird üblicherweise ein sogenannter Immunoassay verwendet. Ein Test, der die Fähigkeit des Immunsystems nutzt, körperfremde Stoffe im Organismus zu erkennen und unschädlich zu machen. Dazu produzieren die Abwehrzellen Antikörper, die körpereigene und -fremde Proteine unterscheiden können. Durch den Einsatz von Antikörpern ist es möglich, Proteine zu binden und mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen oder radioaktiven Markierungen nachzuweisen.
Zwar erzielen auch viele herkömmliche Analysetechniken hohe Nachweisempfindlichkeiten, doch sie erfordern in der Regel einen hohen apparativen Aufwand oder bestehen aus zeitintensiven Mehrschrittverfahren, die für schnelle Kontrollmessungen ungeeignet sind. Ein Immunoassay dauert beispielsweise durchschnittlich mindestens eine Stunde. Bei manchen Problemstellungen stellt die Zeit keine wesentliche Einschränkung dar, doch existieren wichtige Anwendungsgebiete, die eine möglichst schnelle Analyse erfordern. So gibt der Herzmuskel bei einem Herzinfarkt den Stoff Troponin-T ins Blut ab. Der Nachweis dieses Stoffes ermöglicht es dem Arzt, auch einen leichten Infarkt, sogar noch einige Zeit nach dem Ereignis, präzise zu diagnostizieren und von anderen Kreislaufstörungen mit ähnlichen Symptomen zu unterscheiden. Die schnelle und sichere Diagnose ist entscheidend für die richtige Therapie und damit für gute Heilungsaussichten. Wünschenswert ist hier also eine Analysezeit von wenigen Minuten, die mit den derzeitigen Immunoassays nicht zu erreichen ist.
Kurze Ansprechzeiten sind nicht nur in der Medizintechnik, sondern auch in der großtechnischen Prozeßkontrolle erforderlich, um Störfälle rechtzeitig erkennen und beheben zu können. Bei der Suche nach alternativen Nachweistechniken spielen seit einigen Jahren akustische Sensoren eine wichtige Rolle. Ihre wesentlichen Vorzüge bestehen in ihrer geringen Größe und ihrer schnellen Ansprechzeit. Außerdem kann bei ihrer Herstellung auf Produktionsverfahren zurückgegriffen werden, die sich bereits bei der Herstellung integrierter Schaltkreise bewährt haben.
Je nach Einsatzgebiet und Schallwellentyp lassen sich akustische Sensoren in verschiedene Kategorien einteilen. Anfang der 60er Jahre, zu Beginn der Sensortechnik, wies man die Masse von dünnen Schichten nach, die auf der Sensoroberfläche abgeschieden wurden. Bald entstand hieraus die Idee, akustische Sensoren als empfindliche Schichtdickenmeßgeräte in Aufdampfanlagen einzusetzen. Das Verfahren ist noch heute Standard in der Vakuumtechnik. Durch die Verwendung von Oberflächenbeschichtungen, die bestimmte Gase selektiv binden, konnten die relativ einfachen Massedetektoren zu spezifisch reagierenden Gassensoren weiterentwickelt werden. Schwefeldioxid, Kohlenmonoxid, Wasserstoff und Stickstoffdioxid sind nur einige der Gase, die mit Hilfe akustischer Sensoren nachgewiesen werden können. Technische Schwierigkeiten verhinderten zunächst den Einsatz akustischer Bauelemente in der Flüssigkeitssensorik. Die akustischen Wellen, die man für die Messung in der Gasphase einsetzte, wurden in der Flüssigkeit so stark gedämpft, daß am Empfänger kein Signal mehr zu messen war. Um dennoch gelöste Stoffe nachzuweisen, wurden die Sensoren zuerst in die Flüssigkeitsprobe getaucht oder die zu analysierende Flüssigkeit aufgesprüht. Nachdem sie getrocknet waren, konnte das adsorbierte Material wieder in der Gasphase bestimmt werden. Die Wahl geeigneter Wellentypen ermöglicht es heute, akustische Bauelemente auch in direktem Kontakt mit Flüssigkeiten zu betreiben. Das verbessert die Handhabbarkeit, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit akustischer Flüssigkeitssensoren erheblich und erlaubt darüber hinaus eine direkte Kontrolle der stattfindenden Prozesse.
Seit 1990 beschäftigen wir uns am Physikalisch-Chemischen Institut mit der Entwicklung von akustischen Sensoren für den Einsatz in Flüssigkeiten, in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Professor Fabien Josse, Marquette Universität, Milwaukee, USA. Wie sieht ein akustischer Sensor aus? Wir wollen dieser Frage anhand des von uns verwendeten Sensortyps, eines sogenannten APM-, akustischen Plattenmoden-Sensors, nachgehen. Er besteht aus einem Kristallplättchen aus Lithiumniobat. Das ist ein piezoelektrisches Material: Wenn eine Wechselspannung angelegt wird, verzerrt sich das Kristallgitter und die Verzerrung setzt sich als akustische Welle fort. Auf der Unterseite des Kristallplättchens sind kammartige Metallelektroden aufgebracht. Sie dienen als Sender und Empfänger. Üblicherweise sind die Metallschichten nur etwa 100 Nanometer dick, das ist der zehntausendste Teil eines Millimeters. Auf der Oberseite des Sensorkristalls befindet sich die zu untersuchende Flüssigkeit. Die Anregung akustischer Wellen erfolgt mit Hilfe des piezoelektrischen Effektes durch Anlegen einer hochfrequenten Wechselspannung an den Sender. Der Sensorkristall wird periodisch verzerrt und so eine akustische Welle angeregt. Nach mehrfacher Reflexion an den Kristalloberflächen erreicht die Welle den Empfänger und wird wieder in ein elektrisches Signal umgewandelt. Die besondere Attraktivität des Sensordesigns liegt in der strikten Trennung von Flüssigkeit und elektrischen Kontakten. Dadurch vermeiden wir Korrosionsprobleme und erhöhen die Langzeitstabilität und Nutzungsdauer des Sensors deutlich.
Wenn nun Proteine an die Sensoroberfläche binden, erhöht sich die Massebelegung der Oberfläche und die Resonanzfrequenz des Sensors verringert sich. Der Effekt läßt sich mit dem Verhalten einer schwingenden Saite vergleichen, die bei erhöhter Massebelegung einen tieferen Ton erzeugt. - Es sei jedoch angemerkt, daß sich die jeweils maßgeblichen Frequenzbereiche drastisch unterscheiden. Während das menschliche Ohr nur Schwingungen unterhalb von 20 Kilohertz wahrnimmt, arbeiten akustische Sensoren typischerweise im Megahertzbereich, also bei tausendmal höheren Frequenzen. - Mit akustischen Sensoren lassen sich Proteine also direkt und ohne Markierung nachweisen. Die Frequenzverstimmung ist umso größer, je mehr Proteinmasse an die Sensoroberfläche gebunden wird. Um herauszufinden, ob eine Flüssigkeitsprobe ein bestimmtes Protein enthält, beschichten wir die Oberfläche des Sensorkristalls mit einem Film, der nur die gesuchten Teilchen zu binden vermag. Genau wie beim Immunoassay nutzen wir hierbei aus, daß jeder Antikörpertyp nur ganz bestimmte Proteine zu binden vermag, und koppeln an die Sensoroberfläche gezielt jene Antikörper an, die gegen das gesuchte Protein gerichtet sind. Enthält die Flüssigkeitsprobe das Protein, lagern sich Teilchen an der Kristalloberfläche an und rufen eine Frequenzverstimmung des Sensors hervor.
Bei der Messung ist allerdings zu beachten, daß der Sensor nicht nur durch Proteinanlagerungen beeinflußt wird. Auch Änderungen der Temperatur, der Leitfähigkeit oder Viskosität der untersuchten Flüssigkeit können eine Verschiebung der Resonanzfrequenz hervorrufen und so das Meßergebnis verfälschen. In den eigentlichen Untersuchungen setzen wir daher einen Sensorkristall ein, der aus zwei nebeneinander liegenden Sensorbahnen besteht. Die eine dient als Signal-, die andere als Referenzleitung. Beide werden weitgehend nach derselben Methode beschichtet, doch nur die Signalbahn trägt aktive Antikörper. Betrachtet man während eines Experiments den Unterschied im Verhalten von Signal- und Referenzbahn, werden die oben beschriebenen Meßfehler ausgeschaltet, da sich die zugehörigen Einflußgrößen auf beide Bahnen gleichermaßen auswirken. Nach der eher allgemeinen Beschreibung des Funktionsprinzips, soll anhand eines konkreten Beispiels, der Messung eines Antigens aus dem Immunsystem der Ziege, demonstriert werden, daß die von unserer Arbeitsgruppe speziell entwickelten akustischen Sensoren tatsächlich den Nachweis von Proteinen ermöglichen. Dazu beschichteten wir die Oberfläche eines APM-Sensors über eine Kopplungsschicht aus Aminosilan und Glutaraldehyd mit dem Protein "Kaninchen anti-Ziege IgG". Der Antikörper ist in der Lage, Proteine aus dem Immunsystem der Ziege zu erkennnen und spezifisch zu binden. Um eine Degeneration des Antikörpers zu vermeiden, wird die Flüssigkeitszelle des Sensors mit Phosphatpuffer gefüllt. Unter diesen Bedingungen finden keine Reaktionen an der Sensoroberfläche statt, die Meßkurven von Signal- und Referenzbahn verhalten sich zunächst gleichsinnig, die Veränderungen sind temperaturbedingt.
Zwei Stunden später injizierten wir das Protein "Ziege-anti- Kaninchen-IgG-Goldkonjugat" in die Flüssigkeitszelle. Das Protein aus dem Immunsystem der Ziege wird von der Antikörperbeschichtung erkannt und gebunden. Der Zusatz "Goldkonjugat" besagt, daß das verwendete Protein mit einem kleinen Goldpartikel markiert ist. Der Sensor reagiert nun sichtbar mit einer deutlichen Frequenzverringerung auf die zusätzliche Massebelegung der Oberfläche. Geben wir nach vier Stunden wiederum die gleiche Menge desselben Proteins hinzu, führt das nur noch zu einer vergleichsweise geringen Signaländerung. Die Bindungsstellen der Antikörper an der Kristalloberfläche sind bereits nahezu vollständig belegt. Eine erneute Antigenzugabe nach sechs Stunden beeinflußt den Sensor überhaupt nicht mehr. Offensichtlich sind keine freien Bindungsplätze mehr vorhanden. Zur Kontrolle unseres Sensors spritzten wir anschließend Proteine des Typs DKaninchen-anti-Ziege-IgG" in die Flüssigkeitszelle. Diese Antigene können wieder von der obersten Schicht der Antikörper gebunden werden, so daß eine Sandwich-Struktur auf der Kristalloberfläche entsteht. Der Sensor müßte jetzt wieder ansprechen, erwartungsgemäß reagiert er wiederum mit einer Verringerung seiner Resonanzfrequenz. Bei geeigneter Konzeption des Sensors kann der Proteinnachweis sehr schnell erfolgen. Wir haben zum Beispiel mit Hilfe einer Hydrogel- Beschichtung "Kaninchen-anti-Ziege-IgG" als Antikörper auf der Sensoroberfläche fixiert und Proteine des Typs "Ziege-anti-Kaninchen" in die Flüssigkeitszelle injiziert. Bereits nach weniger als zehn Minuten hat sich das Sensorsignal wieder bei einer niedrigeren Resonanzfrequenz stabilisiert. Anhand der Frequenzänderung pro Minute läßt sich bereits nach zwei Minuten das Vorhandensein von "Ziege- anti-Kaninchen-IgG" diagnostizieren. Bei einer Meßfrequenz von 150 Megahertz beträgt die untere Nachweisgrenze unseres Sensors derzeit zirka 0,1 Nanogramm pro Quadratmillimeter und entspricht damit in etwa der Empfindlichkeit üblicher Immunoassays.
Bei der Analyse von Flüssigkeiten mit Hilfe akustischer Sensoren kann nicht nur die oben beschriebene Massenabscheidung an der Kristalloberfläche genutzt werden. Eine akustische Welle, die sich durch einen Kristall bewegt, ruft permanent Deformationen des Kristallgitters hervor. Handelt es sich - wie in unseren Falle - um ein piezoelektrisches Material, entstehen dabei elektrische Wechselfelder, die sich zusammen mit der akustischen Welle ausbreiten. Der Einfluß der elektrischen Felder ist auch außerhalb des Kristalls zu spüren und kann daher ebenfalls zur Messung herangezogen werden. Da die akustische Welle und die elektrischen Felder untrennbar miteinander verknüpft sind, sprechen Physiker oft auch von einer "akustoelektrischen" Welle.
Wir nutzen den beschriebenen Effekt beispielsweise, um die Konzentration von Metallionen in Lösung zu bestimmen. Wird die Oberfläche des Sensors einer Elektrolytlösung ausgesetzt, dringt das elektrische Wechselfeld in die Flüssigkeit ein und bewegt die darin enthaltenen Ladungsträger. Abhängig von der Ionenkon- zentration ändert sich die Resonanzfrequenz des Sensors und es sind Energieverluste zu beobachten. Akustische Sensoren eignen sich daher als empfindliche Konzentrationsmeßgeräte, die nur sehr kleine Flüssigkeitsmengen benötigen. Es sind zudem sehr robuste Nachweisgeräte mit langer Lebensdauer, da für diese Art der Flüssigkeitsanalyse keine Beschichtung der Sensoroberfläche notwendig ist. Ein Nachteil besteht allerdings darin, daß die elektrischen Felder mit allen gelösten Ionen reagieren und daher vor der Konzentrationsbestimmung die Art der Lösung bekannt sein muß. Für die Analyse einer kleinen Auswahl verschiedener Lösungen läßt sich dieser Nachteil mit Hilfe von Mustererkennungsmethoden beheben. Dazu wird die Reaktion des Sensors auf eine unbekannte Flüssigkeitsprobe bei verschiedenen Temperaturen gemessen und das beobachtete Verhalten mit bekannten Referenzproben verglichen. Mit Hilfe derartiger Techniken können Art und Konzentration einer unbekannten Metallionenlösung korrekt bestimmt werden. Versuche unserer Heidelberger Arbeitsgruppe, Elektrolytmischungen zu identifizieren, zeigen bereits erste Erfolge, befinden sich aber noch im Anfangsstadium. Die Anwendung von Mustererkennungsmethoden kann jedoch nur dann erfolgreich sein, wenn die zu untersuchende Flüssigkeit nur wenige verschiedene Komponenten enthält. Für die Analyse einer Probe weitgehend unbekannter Zusammensetzung empfiehlt es sich in jedem Fall, die gesuchte Substanz mit Hilfe selektiver Beschichtungen auf der Sensoroberfläche abzuscheiden und nachzuweisen.
Unsere bisherigen Studien zeigen, daß APM-Sensoren ein geeignetes Mittel zum Nachweis gelöster Stoffe darstellen und eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Analysemethoden bieten können. Um die Empfindlichkeit der eingesetzten Sensoren weiter zu erhöhen, arbeiten wir zur Zeit an einer Verbesserung des Sensordesigns und der Optimierung der Sensorbeschichtungen.
Ein neuer Forschungschwerpunkt beschäftigt sich mit der Anlagerung von Proteinen an künstliche Oberflächen. Es handelt sich um eine Fragestellung, die sowohl in der Biotechnologie als auch in der Medizin eine wichtige Rolle spielt. Dafür stellen wir in der Adsorptionschromatographie hochreine Proteinproben her, indem ein bestimmter Proteintyp spezifisch an die Wand eines geeigneten Gefäßes gebunden wird. Unspezifische Anlagerungsprozesse reduzieren die Reinheit des gebundenen Materials und verschlechtern die Effizienz des Trennverfahrens. Durch die Bindung pharmazeutischer Proteine auf den Glas- oder Plastikwänden des Behälters wird ihre Aktivität und somit ihre Wirksamkeit bei medizinischen Anwendungen beeinflußt. Die Oberflächeneigenschaften künstlicher Materialien sind außerdem wichtig im Falle implantierter Prothesen, Sensoren, Herzklappen oder Katheter. Dabei stellt das Adsorptionsverhalten von Proteinen an der jeweiligen Oberfläche den ersten Schritt eines Prozesses dar, der letztendlich zur Anlagerung von Zellen und zur Einbindung des Fremdmaterials in den Körper oder zur Abstoßung und zur pathologischen Reaktion führt. Mit Hilfe akustischer Sensoren will unsere Arbeitsgruppe daher untersuchen, wie schnell Protein- oder Zellanlagerungen an speziell hergestellten künstlichen Oberflächen erfolgen, und welche Eigenschaften künstliche Materialien aufweisen müssen, um entsprechende Adsorptionsprozesse zu unterbinden.
Autor:
Prof. Dr. Michael Grunze, Dr. Reiner Dahint, Heribert Quirrenbach
Physikalisch-Chemisches Institut, Im Neuenheimer Feld 253, 69120 Heidelberg,
Telefon (06221) 56 24 61
